检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

摘要：向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害．针对这2种致病菌，目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究，但未见有2种病原菌同步分子检测的报道．本研究首先通过培养，观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征．发现前者菌落絮状，分生孢子器深褐球型，分生孢子为单胞肾形；后者菌落短绒毛状，分生孢子器柠檬黄，分生孢子为线型．通过油菜黑茎病菌L．biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物actF／actR，扩增产物片段约为720bp，然后采用真菌通用引物1Tsl／ITs4和引物actF／actR，针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增，经克隆测序结果比对分析发现，向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度．因此，依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF／LLR和DHF／DHR．在同一PCR管中3组引物（ITS1／ITS4，LLF／LLR和DHF／DHR）经优化体系后，ITS1／ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控，针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增．利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580bp的ITS保守区扩增片段和255bp的Actin基因的特异扩增带，向日葵茎渍疡病菌出现580bp的ITS保守区扩增片段和394bp的Actin基因特异扩增带．所有菌株均未见非特异性片段的干扰．此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法．